肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）的91.5%，预后较差，总的5年生存率不足5%［1-2］，主要原因是其高转移率及术后的高复发率［3-4］。因此，肝癌的抗侵袭转移成为改善预后的重要治疗策略。血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）是一种区别于经典的肿瘤血管生成途径、不依赖血管内皮细胞的肿瘤微循环模式，其在肿瘤生长、转移过程中产生重要作用［5-6］。然而，常规的针对血管内皮细胞（VEC）的抗血管治疗方案对VM无效［7］，并且治疗过程中造成的肿瘤局部缺血缺氧反而促进了VM的形成［8］，增加了肿瘤通过VM侵袭转移的机会。因此，在抗肿瘤血管生成治疗中必须联合抗VM的方案。故寻找针对VM的治疗靶点对于HCC的治疗具有十分重要的意义。

迁移诱导基因7（migration-inducing gene7,Mig-7）表达一种在多种肿瘤细胞膜定位的富含半胱氨酸的蛋白质，在肿瘤的可塑性和VM形成中具有重要作用［9-10］。Mig-7在正常组织和无VM形成的低侵袭性肿瘤细胞中均不表达，只在能形成VM的高侵袭性肿瘤细胞中表达［11-12］。目前有研究表明Mig-7基因与胃癌中VM的形成有关［13］，然而，国内外对于Mig-7基因对HCC中VM形成及侵袭转移能力影响的报道较少见。在前期实验基础上，我们推测Mig-7对HCC的VM形成和侵袭转移有重要的调控作用，可能是恶性肿瘤靶向治疗的一个理想靶点。

本研究将通过构建特异性Mig-7shRNA逆转录病毒表达载体质粒，转染Mig-7高表达人HCC细胞MHCC-97H，观察其对MHCC-97H细胞Mig-7表达、VM形成能力及细胞间粘附、侵袭及转移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人HCC细胞株MHCC-97H购自复旦大学中山医院肝癌研究所。兔抗人Mig-7抗体购自美国Abcam公司；引物由宝生物公司设计和合成；LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司；Matrigel购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；重组人血管内皮抑素（ES，商品名：恩度）购自先声麦得津生物公司。

1.2 shRNA的设计合成

从Genbank获得人Mig-7 mRNA的基因序列（GenBank：DQ0.2）。依据shRNA的设计原则［14］，设计针对Mig-7mRNA基因CDS区的shRNA序列，利用BLAST比较设计的序列和人类基因组数据库，排除和其他基因明显同源的靶序列，设计3条序列，包括2条Mig-7 mRNA的寡核苷酸序列（Mig-7 shRNA-1，Mig-7 shRNA-2）和1条作为负对照的无关序列（Mig-7 shRNA-N）。Mig-7 shRNAs由宝生物公司设计合成并进行荧光标记，具体如下：Mig-7 shRNA-1正义链：5'-GATCCAAAGTTTCATTCTTCGACTTCAAGAGAG TCGAAGAAATGAAACTTTTTTTTTG-3'，反义链3'-GTTTCAAAGTAAGAAGCTGAAGTTCTCTCAGCT TCTTTACTTTGAAAAAAAAACTTAA-5'；Mig-7 shRNA-2正义链：5'-GGATCCCACAGCTTGAGTG GAATACTTCAAGAGAGTATTCCACTCAAGCTGT GTTTTTTG-3'，反义链3'-GGTGTCGAACTCACCT TATGAAGTTCTCTCATAAGGTGAGTTCGACACA AAAAACTTAAG-5'；Mig-7 shRNA-N正义链：5'-G GATCCTGATAAACGAACTGCGCGTTTCAAGAG AACGCGCAGTTCGTTTATCATTTT TTG-3'，反义链3'-

GACTATTTGCTTGACGCGCAAAGTTCTCTTGCG CGTCAAGCAAATAGTAAAAAACTTAAG-5'。

1.3 Mig-7 shRNA转染MHCC-97H细胞

MHCC-97H细胞常规培养于37℃、5%CO2培养箱中，培养液为含10%FBS的DMEM高糖培养液。转染前24 h，调整细胞浓度为4×105/mL，以0.5 mL/孔于24孔培养板培养过夜，MHCC-97H细胞培养达到80%～90%融合后进行转染，参照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent说明书（Invitrogen）进行转染。将要接受转染的MHCC-97H细胞分为4组：（1）转染Mig-7 shRNA-1组；（2）转染Mig-7 shRNA-2组；（3）转染Mig-7 shRNA-N组；（4）转染空载体质粒组（Vector）。各组分别在转染24 h后于荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白标记，各组随机选择10个视野，计数绿色荧光蛋白标记阳性细胞数、细胞总数，转染效率为绿色荧光蛋白标记阳性细胞数占细胞总数的百分比。

1.4 半定量PCR检测Mig-7 mRNA表达

将培养的MHCC-97H细胞分为6组：（1）转染Mig-7 shRNA-1组；（2）转染Mig-7 shRNA-2组；（3）转染Mig-7 shRNA-N组；（4）转染空载体质粒组（Vector）；（5）ES组：给予ES125 μg/mL［15］；（6）MHCC-97H细胞对照组（Control）。提取总RNA，反转录成cDNA，扩增目的基因。反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性10 s，60℃退火、延伸30 s，反应40个循环。扩增基因的特异性引物序列为：β-actin：正义引物：5'-ATCGTGCGT GACATTAAGGAGAAG-3'，反义引物：5'-AGGAAG GAAGGCTGGAAGAGTG-3'；Mig-7：正义引物：5'-TC TCAGGCAGTCAGTGGG-3'，反义引物：5'-GTTGGA TGG GATGTCTCG-3'。

1.5 Western blotting检测